איך לבחור מקדם אתרים

בשל תפקידם החשוב של היזמים בתעתיק גנים, חיזוי מדויק של אתרי היזמים הפך לחלק חשוב בהבנת תפקודן של רשתות רגולטוריות גנטיות. מגוון אלגוריתמים פותחו כדי להקל על גילוי האמרגן ברצפים גנומיים, אך חיזוי היזם הוא רק אחד משלבים רבים הנדרשים בתהליך זה. לעתים קרובות שואלים אותי לגבי הדרך הטובה ביותר לייצר RNA הולכה Cas9, וחילקתי את היסטוריית ה- RNA ההולכה למספר מאמרים ואנשים ומקומות.

כדי לבחור מקדם על פי סוג תעתיק ה- RNA, עלינו לוודא שלפלסמיד יש מקדמים המתאימים לעבודה באורגניזם המארח. אם אתה יוצר היתוך תמלול ומשתמש בווקטור עם נקודת התחלה של תעתיק, הכנס נקודת התחלה אחת לתעתיק. זה עשוי לכלול את כל המקדם הפרוקסימלי, כולל הקילו 1 מול המפתח.

אמנם הרבה יותר מסובך

אך חשוב יהיה להרחיב גישה חדשה זו לאתרי השקה שאינם ממוקדים על ידי בחינה האם היזמים הללו מכילים את אלמנט ה- Inr. לדוגמא, עלינו לשקול משפרי דרך הרחק מנקודת ההתחלה של ה- mRNA, כגון מקדמי הכרומטין שנוצרו או נבנו מחדש.

על ידי סריקת כל היזם שנקבע בגרסה מחליפה

אנו יכולים לקבוע את אתר הכריכה של אלמנט Inr עבור כל יזם בגנום. אנו יכולים גם להשיג אתרי קשירה לאתרים מעניינים אחרים, כמו אלה של גנים אחרים, על ידי סריקת הגנום כולו, ולא מקדם אחד בלבד. על ידי סריקת קבוצות שלמות של מקדמים בגרסת הפרמטר של כל מקדם (כלומר המספר הכולל של אתרים, ולא רק אתרים), נוכל להשיג אתרים קשורים.

ישנם יותר מוטיבים של TATAAA בגנום מאשר אזורי היזם

והיזם נמצא בנקודת התעתיק במעלה הזרם – נקודת ההתחלה של תיבת ה- TATA. ישנם יזמים איקריוטים ידועים (למשל האמרגן E. coli), המכילים תיבת "TATA" במצב 30. Bp במעלה הזרם מנקודת התחלת התעתיק, אך לא מהמקום ממנו מתחיל התעתיק בנקודה זו.

אזורי יזם יכולים להיות קצרים או ארוכים

אך ככל שהמקדם ארוך יותר, כך יש יותר מקום לחלבונים להיקשר אליו. היזמים יכולים גם להיות ארוכים יותר מבחינת מספר אזורי היזם וכמות קשרי החלבון הקיימים בחדר זה, קצרים וארוכים יותר. ההצעות יכולות להיות ארוכות מספיק כדי שהחלבון ייקשר לכל האזורים הזמינים, או קצרות מספיק כדי שייקשר רק לחלק קטן מחלבון היעד שלו.

ככל שאזור היזם קרוב יותר לקונצנזוס הרצף, כך מתרחש תעתיק הגן. למרות שרמות התמלול הכוללות של היזמים במדגם לא השתנו, השימוש השונה ב- TSS ובמשמרות היזם מצביע על כך שפרופיל הביטוי אינו מזהה שינויים בוויסות התמלול של היזם.

האמרגן 5 והאזורים הסמוכים עשויים להכיל מספר רב של חלבונים המשמשים ליזום שעתוק. Inr, המופץ באופן אקראי בכל הגנום, נמצא כמקדם לנקודות התחלה ממוקדות של תעתיק.

אם שום דבר לא ידוע על הגן המקדם שמעניין

שיטה גסה אך מוכחת – ונכונה – היא פשוט להשתמש ב 1-3 קילו-בייט לפני הגן. פולימראז ה- RNA ייקשר לאזור היזם וניתן להתחיל שעתוק על גדיל התבנית. אם רצף האינטרסים צפוי לשפר את התעתיק בלבד, עליך להשתמש בווקטור מקדם מינימלי כדי להשיג רקע איתות בסיסי. עם זאת, אם הוא מוטבע באזור מקדם ומכיל את כל המרכיבים הדרושים לשעתוק בסיסי, וקטורים ללא יזם מתאימים.

במחקרנו ניגש לאנזים שנמצא בבארגן הנבדק Escherichia coli RNAP מקדם קוגניטי או עבר את סף יעד החלבון המחושב לאחר קשירה ישירה ליזם

הקישור הישיר מסביר מדוע פולימראז יכול להגיע ליזמים לפני קשירת חלבונים, מה שיעכב את FD. הכללת דיפוזיה 1D יוצרת למעשה יעד גדול יותר לקשירה, כולל DNA שמאוגד על ידי היזמים, שמאיץ את המהירות שבה חלבונים מוצאים יזמים. מדהים כי רצפי היזמים מציגים מאפיינים מבניים ודינמיים יוצאי דופן, לפיהם הקונפורמציה של ה- DNA המועדפת על ידי פולימראזות מתיישבת מאוד אצל היזמים ורק לעיתים נדירות ב- DNA גנרי. מקטעי ה- DNA מאגפים את רצף היזמים ואת נוכחותם של מספר רב של נוקלאוטידים ברצפי ה- DNA של היזם.

קיצור או ביטול דנ"א איגוף אמור להפחית את קצב הכריכה של היזמים, מכיוון שהכריכה הלא ספציפית לרצפי הפלוקציה ממלאת תפקיד בחיפוש אחר היזמים.

באיקריוטים

התהליך מורכב יותר, ורצף אזורי היזם שולט על קשירת פולימראזות RNA וגורמי שעתוק. באורגניזמים, ה- DNA מכיל אתרי קשירה רבים ליד מקדם, מקומות רבים מאכלסים גם כאשר האמרגן מופעל. היזמים מבטיחים כי פולימרזת ה- RNA מגיבה רק לגנים ולא לחלקים אחרים של ה- DNA. לכן, היזמים ממלאים תפקיד חשוב בקביעת היכן ומתי מביע גן עניין. לפחות שבעה גורמים שונים קובעים את תעתיק הגנים, שכל אחד מהם ספציפי לאזור מקדם מסוים בגן מסוים.